Administration intrathécale de virus dans un modèle murin pour le traitement de maladies du système nerveux central

Résumé

Source : Li, D., et al. Injection intrathécale directe de virus adéno-associés recombinants chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la procédure d’injection intrathécale de virus adéno-associés (AAV) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) d’une souris éveillée, couvrant la préparation de la seringue, l’alignement de la colonne vertébrale et l’insertion précise de l’aiguille. Cette méthode valide l’administration ciblée de gènes, soutenant ainsi son potentiel pour les thérapies du SNC.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la solution mère de chlorhydrate de lidocaïne à 20 %

1. Peser 2 g de chlorhydrate de lidocaïne. Ajouter 5 à 6 ml d’eau stérile et agiter doucement. Augmentez le volume à 10 mL avec de l’eau stérile.
2. 1.2 Filtrer la solution mère à travers des filtres de 0,2 micron. Aliquoter la solution mère, 1 mL par tube de microcentrifugation de 1,5 mL, et la sceller avec un film d’étanchéité. Conserver à 4 °C.

2. Administration intrathécale directe d’AAV chez les souris éveillées

1. Essuyez la zone de travail à l’aide d’une gaze stérile contenant de l’éthanol à 70 % et préparez les fournitures nécessaires.
2. Préparez 100 μL de complexe de chlorhydrate de lidocaïne AAVrh.10/1 % en ajoutant 95 μL de solution mère rAAVrh10 (5 x^{10 12} copies du génome/mL) dans un tube de microcentrifugation stérile de 200 μL, et ajoutez 5 μL de solution mère de chlorhydrate de lidocaïne à 20 %. Bien mélanger en pipetant de haut en bas. Ensuite, conservez la solution virale sur de la glace (4 °C).
   REMARQUE : 8 μL par souris seront utilisés.
3. Préparation de la seringue avec la solution d’injection AAV
   1. Assemblez une seringue Hamilton de 25 μL avec une aiguille de 27 G et alignez la pointe biseautée de l’aiguille avec l’échelle volumétrique de la seringue.
   2. Prélevez doucement 8 μL avec 4 x¹⁰ copies du génome de la solution virale dans la seringue. Assurez-vous d’éliminer les bulles d’air.
4. Préparation de la souris
   REMARQUE : Cette étude a utilisé des souris FVB/NJ mâles ou femelles (âgées de 30 à 70 jours). L’injection informatique a été réalisée dans le capot.
   1. Stérilisez la zone de travail dans une hotte avec de l’éthanol à 70 %. Placez la souris éveillée (mâle ou femelle, âgée de 30 à 70 jours, poids de 13 à 20 g) sur un chevet en position couchée dans le capuchon. Couvrez le haut du corps avec de la gaze stérile pour calmer la souris et éviter d’être mordue.
   2. Fixez l’animal en le saisissant correctement et fermement sur sa ceinture pelvienne avec le pouce d’un côté et l’index/majeur de l’autre. Gardez la peau entre les ceintures pelviennes bilatérales tendues avec le pouce et l’index. Tenez doucement le haut du corps de l’animal avec la paume.
   3. Rasez la fourrure sur le dos entre les ceintures pelviennes bilatérales, puis stérilisez la surface de la peau avec un gommage à base d’iodure et d’éthanol à 70 %.
5. Injection intrathécale
   1. Sentez l’espace intervertébral le long de la ligne médiane entre les ceintures pelviennes bilatérales avec un pouce ou un index de l’autre main et appuyez sur une empreinte avec un ongle pour indiquer l’espace intervertébral L5-L6 (localisez le site d’injection).
   2. Tournez légèrement et doucement la base de la queue pour indiquer la ligne médiane de la colonne vertébrale. Ajustez le biseau de l’aiguille vers la tête de l’animal avant l’injection.
   3. Assurez-vous que les animaux sont fermement fixés et alignez l’aiguille le long de la ligne médiane de la colonne vertébrale.
   4. Insérez l’aiguille doucement et verticalement (ou inclinez-la légèrement de 70 à 80°) à l’intersection de l’indentation, en maintenant la seringue dans un plan sagittal central. Réduisez lentement l’angle à environ 30° lorsqu’il relie l’os, puis glissez l’aiguille dans l’espace intervertébral.
      REMARQUE : Un coup de queue soudain évident est un signe d’entrée réussie dans l’espace intradural. Une fois que l’aiguille pénètre dans l’espace intervertébral, la pointe de l’aiguille sera fermement serrée. L’aiguille de 27 G utilisée dans cette étude est adaptée à l’administration d’IT chez les souris, mais pas chez les rats.
   5. Injectez la solution vectorielle. Démarrez la minuterie et injectez 8 μL de la solution vectorielle à une vitesse de 1 μL/4 s. Conservez l’aiguille environ 1 minute après la fin de l’accouchement. Retirez l’aiguille avec une rotation douce pour éviter les fuites.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FVB/NJ souris	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core du Centre de thérapie génique de l’Université de Massachusetts Medical School
25μL Hamilton seringue/27-30g aiguille	GASTIGHT	1702
70 % Ethanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	5171112	8cm * 10cm * 12cm